在抗体内吞实验中，一个常见难点是区分细胞表面结合的抗体与进入胞内的抗体。普通荧光标记下，两部分都可能贡献信号，增加结果判读的难度。
启和 pHrodo 系列利用环境酸化后荧光增强的特性，帮助观察标记物进入酸性胞内区室后的变化。系列覆盖 pHAb、pH560 Red、pH630 Deep Red，以及面向人源抗体的快速标记试剂，可根据实验通道、抗体状态和标记策略选择。
pHrodo 染料如何用于抗体内吞研究
这类染料在中性环境中荧光较弱。当标记抗体被细胞摄取，进入逐渐酸化的内体与溶酶体系统后，局部 pH 降低，荧光信号随之增强。利用这一变化，可以观察不同时间点或处理条件下的酸化相关荧光读出。
这一特性有助于降低中性胞外环境中标记物带来的背景干扰，适合用于抗体内化、受体介导摄取，以及相关内吞和吞噬研究。用于抗体筛选时，可将该读出与靶点结合、细胞状态等结果结合分析。
图1 抗体内化与酸化相关荧光变化的原理示意，非实测图。不同型号的响应范围与实验条件以对应说明书为准。
pHAb、pH560 Red 和 pH630 Deep Red 怎么选
先确认仪器的检测窗口，再选择反应形式与样本处理流程。
| 产品 | 光谱信息 | 可选反应形式 | 选型重点 |
|---|---|---|---|
| pHAb | 最大吸收／发射 532／560 nm | NHS 酯、Maleimide | 抗体内化研究，可根据样本状态选择溶液法或磁珠法 |
| pH560 Red | 激发／发射峰值 560／585 nm | TFP 酯、Maleimide | 将抗体或蛋白等标记物的酸化相关读出安排在红光检测窗口 |
| pH630 Deep Red | 激发／发射峰值 640／655 nm | TFP 酯、Maleimide | 在深红检测窗口观察晚期内体、溶酶体等酸性区室相关信号 |
pHAb：兼顾抗体样本状态。支持溶液法与磁珠法；磁珠路径可衔接抗体纯化与标记，为低浓度或未纯化抗体提供可评估的处理方案。规格为 250 μg 和 1 mg。
pH560 Red：为红光检测窗口提供选择。TFP 酯用于伯胺标记，Maleimide 用于游离巯基标记，可结合抗体或蛋白的可用基团安排偶联。两种形式均提供 100 μg 和 1 mg 规格。
pH630 Deep Red：关注酸性区室中的深红信号。近似 pKa 为 5，可结合标准 Cy5 滤光片组规划检测。当实验已有绿色标记，希望将酸化相关读出放在深红通道时，可优先评估这一选择。具体信息可查看 pH630 Deep Red Maleimide 产品页。
图2 pH630 产品资料中的 pH 响应曲线。相对荧光强度（RFU）随环境酸化而增强。原资料未附完整测试条件，本图用于展示响应趋势，不用于跨产品性能比较。
表中波长为峰值信息，不等同于仪器激光器波长。pHAb 与 pH560 Red 的波段相邻；多色实验应结合实际激光器、滤光片和其他染料评估串色。
人源抗体内吞研究可选快速标记方案
对于希望减少标记前处理步骤的人源抗体内吞研究，启和提供 pH630 Deep Red anti-human labeling reagent，货号 QH-17-1003。
该试剂可在培养基中与待测人源抗体混合，无需更换抗体原有缓冲液；按对应说明书流程孵育标记后，再加入细胞检测体系。其激发／发射峰值为 640／655 nm，浓度为 0.5 mg/mL，包装为 200 μL。
这一配套方案与单独销售的反应性染料具有不同的使用流程，选用时应先确认待测抗体的适用性。
标记路线取决于目标分子的可用基团
采用共价标记时，可用伯胺对应 pHAb NHS 酯或 pH560／pH630 TFP 酯；可用游离巯基对应 Maleimide。需要还原二硫键时，应按具体抗体和试剂流程处理，并验证标记后的抗体结合表现。
胺反应型染料应使用适合反应的缓冲体系，关注 Tris、甘氨酸等游离胺的干扰；巯基路线则要确认游离巯基及残余还原剂。投料量、反应 pH、时间和后续纯化分别按对应型号说明书安排。
如何理解荧光增强的结果
pHrodo 染料的荧光信号主要反映标记物所处环境的酸化情况。读数还受到标记量、细胞状态等因素影响。比较不同抗体或处理条件时，建议结合未标记、阴性及时间点对照，并关注标记度的一致性。
对于尚未充分酸化的早期内吞阶段，仅凭荧光较弱不能判断没有发生内吞；如果研究重点是总内吞量或特定转运步骤，应配合适合该问题的其他检测方法。
从样品和检测通道开始选型
准备开展抗体内吞、蛋白摄取或吞噬相关研究时，可先整理待标记分子的种类、抗体来源、浓度与缓冲液配方，以及仪器通道和希望观察的时间范围。
欢迎通过 启和技术咨询入口 获取系列产品说明书、规格与选型建议；如需评估标记服务，也可一并提供样品信息，确认适用方案。
本系列产品仅供科研使用。