产品说明书
产品用途、配制、操作与储存要求。
应用与检测原理
荧光随环境酸化增强。读数同时受标记量、内化量、局部 pH 和采集条件影响；比较实验时应保持标记度和仪器设置一致。
- 1细胞表面结合细胞膜
- 2内吞进入细胞
- 3酸性区室酸性内体 / 溶酶体
抗体内化
比较靶标阳性和阴性样品，记录时间序列。结合抗体结合活性，判断荧光变化是否与受体介导的内化相关。
内吞与酸化
把探针与待追踪分子偶联后再检测。使用独立的定位或酸化对照，区分摄取量变化和细胞器酸度变化。
多色检测
按实际激发、发射峰和滤光片带宽安排通道。采用单染对照评估串色，避免把仪器自动增益变化当成样品差异。
技术参数
产品信息
- 产品名称
- pH630 Deep Red 马来酰亚胺
- 货号
- QH-17-1002
- 产品形式
- 马来酰亚胺
- 反应或标记对象
- 可接近的游离巯基
- 激发 / 发射峰
- 640 / 655 nm
- 包装规格
- 100 μg / 1 mg
配制与理化参数
- 配制溶剂
- 无水 DMSO 或 DMF；临用前配制
- 储存条件
- −20°C，避光、干燥保存，避免反复冻融
- 摩尔消光系数
- 140,000 M⁻¹ cm⁻¹；4.3%（w/w）磷酸条件
- 近似 pKa
- 约 5
- A280 / A260 校正因子
- 0.33 / 0.14；在 4.3%（w/w）磷酸中测定
- 保存稳定性
- 按说明书条件于 −20°C 保存，至少 6 个月
荧光响应随检测环境改变。吸光度校正与标记度计算应使用本品参数和对应测量条件。
使用方法
按对应说明书确定投料、反应条件与纯化方式。
01核对游离巯基与还原条件
先确认样品是否已有可用游离巯基。需要还原时评价对蛋白结构和结合活性的影响；去除 DTT 等竞争性巯基成分，并核对其他还原剂的相容性。
02临用前配制染料
密封回温后开盖，使用无水 DMSO 或 DMF 配制，避光操作。避免受潮，配制后尽快用于标记。
03控制标记程度
按对应反应形式确定缓冲液和用量。先小规模比较标记程度、蛋白回收和结合活性，再放大；高标记度不一定带来更好的检测结果。
04去除游离染料
采用适合目标分子大小的纯化方式，确认未结合染料已去除。保留未标记蛋白作为结合和背景对照。
05确认偶联物的 pH 响应
在匹配浓度和采集设置下比较中性、酸性条件的信号，再进入细胞实验。培养基组成、样品状态和标记度均应记录。
产品资料申请
点击所需资料，留下接收邮箱；申请 CoA 时请提供产品批号。
pH630 Deep Red 马来酰亚胺QH-17-1002
批次分析证书（CoA）
对应批次的检验项目与结果。
安全数据表（SDS）
安全操作、储存及应急处置资料。
技术文章
pHrodo 抗体内化检测与产品选型
比较 pHAb、pH560 Red、pH630 Deep Red 与人源抗体配套标记试剂的检测通道和反应路线，结合样品状态安排内化检测。
NHS 酯与 Maleimide 的抗体标记路线
NHS 酯用于伯胺标记，马来酰亚胺用于游离巯基标记。结合抗体可用基团、缓冲液与还原处理，判断两种路线的适用条件，并列出标记前应提供的样品信息。
抗体标记度 DOL 的计算与评估
DOL 表示纯化后平均每个抗体结合的染料分子数。本文说明如何用 A280、染料吸光度和对应消光系数计算标记度，排查游离染料、错误校正和过度标记，并结合实际染色表现判断标记结果。
pHrodo 抗体内化的对照设计与读数分析
用对照区分靶向摄取、非特异摄取和酸化变化；明确荧光读数能回答的问题。
pHrodo 高背景与弱信号排查
按“无细胞响应—结合—细胞读数”定位问题，避免一开始就增加染料或抗体用量。
相关文献
以下为方法与应用研究，所用试剂见各篇原文，不作为启和产品的验证数据。
Intracellular Delivery and Trafficking Dynamics of a Lymphoma-Targeting Antibody–Polymer Conjugate
Berguig GY, et al. · Mol Pharm. 2012;9(12):3506–3514.
研究要点与应用
- 研究体系
- CD22 阳性细胞中的 HD39 抗体体系，使用 Alexa Fluor 488 与 pHrodo 双标记。
- 方法要点
- 结合比率荧光、成像与流式检测，分析标记分子经历的胞内酸度变化。
- 实验设计中的用途
- 适合了解参照通道与校准的作用。单通道强度或未经校准的双通道比值，都不能直接换算为绝对 pH。
Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye
Nath N, et al. · J Immunol Methods. 2016;431:11–21.
研究要点与应用
- 研究体系
- pHAb 标记的曲妥珠单抗（HER2）与西妥昔单抗（EGFR），采用微孔板荧光读数。
- 方法要点
- 比较胺反应、巯基反应及染料/抗体比例对内化检测的影响。
- 实验设计中的用途
- 用于设计标记路线与结合活性的平行比较。论文中的比例属于其抗体和染料体系，不能直接作为所有产品的投料条件。
Avelumab internalization by human circulating immune cells is mediated by both Fc gamma receptor and PD-L1 binding
Jin H, et al. · Oncoimmunology. 2021;10(1):1958590.
研究要点与应用
- 研究体系
- pHrodo 标记的 avelumab 及抗体变体，研究人血液免疫细胞中的摄取。
- 方法要点
- 区分 Fcγ 受体结合与 PD-L1 结合对抗体内化的贡献。
- 实验设计中的用途
- 涉及免疫细胞时，应考虑 Fc 相关摄取，不能把全部荧光归因于靶点。是否加入 Fc 阻断取决于研究目的。
Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores
Liao-Chan S, et al. · PLoS One. 2015;10(4):e0124708.
研究要点与应用
- 研究体系
- Alexa Fluor 标记的抗 EphA2 抗体，配合抗荧光团抗体淬灭细胞表面信号。
- 方法要点
- 通过区分表面与胞内信号，追踪抗体内化；不依赖酸性荧光增强。
- 实验设计中的用途
- 为摄取量与酸化变化提供互补验证思路。所用淬灭抗体针对 Alexa 荧光团，不应直接用于 pHrodo 染料。
常见问题
这款染料适合标记什么？
pH630 Deep Red 马来酰亚胺用于标记可接近的游离巯基。含有半胱氨酸不等于已有可反应巯基，应先确认其是否处于游离状态。
查看相关技术文章 →可以用游离染料直接检测细胞内 pH 吗？
本品用于制备标记偶联物，不是直接加样的通用胞内 pH 探针。先与目标分子偶联并去除游离染料，再观察标记物进入酸性环境后的信号。
查看相关技术文章 →pH630 要用 630 nm 激发吗？
630 是系列名称。本品的激发/发射峰为 640/655 nm，检测时应核对实际激光线和远红发射滤光片。仅凭产品名称不能判断仪器是否匹配。
查看相关技术文章 →用什么溶剂配制？可以只加水吗？
使用无水 DMSO 或 DMF，密封回温后再开盖配制，尽快用于标记。不要用水代替说明书规定的母液溶剂，以免影响活性基团和标记结果。
查看相关技术文章 →一定要还原抗体吗？DTT 可以留在反应里吗？
若样品已有可用游离巯基，不应默认再还原。需要暴露巯基时，先评价还原对结构和结合的影响。DTT 等含巯基还原剂会竞争消耗 Maleimide，应在偶联前去除；其他还原剂也需核对相容性。
查看相关技术文章 →未配制的染料怎样保存？
−20°C，避光、干燥保存，避免反复冻融。开盖前让密封瓶回温，减少受潮；配制后的溶液应按对应说明使用，不沿用干粉保存期限。
检测信号弱，是否应该先增加用量？
先检查通道，以及纯化后偶联物在酸性条件下是否有响应。若响应正常，再检查标记后结合活性、靶标表达和细胞状态。直接加量可能同时抬高非特异背景。
查看相关技术文章 →荧光越强，就说明内化越多吗？
不一定。信号还受局部 pH、标记度和细胞数量影响。比较不同抗体时，应同时记录结合活性与标记度；需要区分摄取和酸化时，增加独立的胞内定位或摄取读数。
查看相关技术文章 →染色后可以固定或通透吗？
不能默认固定后仍保留原来的 pH 读数。固定、通透和换液都可能改变标记物所在环境。若研究活细胞内化，优先在活细胞条件下检测；必须固定时，应先比较处理前后的响应和定位。
查看相关技术文章 →需要对应产品的操作说明？
申请说明书时，可附上抗体类型和检测需求。