NHS 酯活化染料蛋白标记
蛋白标记使用 NHS 酯活化荧光染料对蛋白质（抗体、BSA 等）赖氨酸残基进行共价标记的标准流程。
操作步骤
- 1将目标蛋白溶解于 0.1 M NaHCO₃ 缓冲液（pH 8.3–8.5），浓度 1–10 mg/mL
- 2称取适量 NHS 酯染料，溶于无水 DMSO 或 DMF 中（终浓度约 10 mM）
- 3按染料:蛋白摩尔比 10:1 – 20:1，在搅拌下逐滴加入染料溶液
- 4室温避光反应 1–2 小时（或 4°C 过夜）
- 5使用 Sephadex G-25 或 PD-10 脱盐柱去除未反应染料
- 6测定标记率（DOL）——A₂₈₀ 和染料 λmax 吸光度计算
- 7标记产物 4°C 避光保存，建议添加 0.02% NaN₃
💡 注意事项：缓冲液不得含伯胺（Tris、甘氨酸等），否则与标记反应竞争。推荐使用碳酸盐或磷酸盐缓冲液。
马来酰亚胺巯基标记
蛋白标记利用马来酰亚胺基团与蛋白游离巯基（半胱氨酸残基）的选择性反应进行位点特异性标记。
操作步骤
- 1蛋白溶于 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0–7.5），含 5 mM EDTA
- 2若蛋白不含游离巯基，可用 TCEP 或 DTT 还原二硫键（2–10 mM，室温 30 min）
- 3还原后立即脱盐去除过量还原剂
- 4按染料:蛋白摩尔比 5:1 – 15:1 加入马来酰亚胺染料（DMSO 溶解）
- 5室温避光反应 2 小时（或 4°C 过夜）
- 6加入 N-乙基马来酰亚胺（NEM，终浓度 1 mM）淬灭未反应染料
- 7脱盐纯化，测定标记率
💡 注意事项：全程保持 pH 7.0–7.5——pH > 8 时马来酰亚胺会与胺基非特异性反应。
铜催化点击化学标记 (CuAAC)
点击化学利用叠氮化物-炔基环加成（CuAAC）反应，对含炔基或叠氮基修饰的生物分子进行荧光标记。
操作步骤
- 1将炔基/叠氮修饰的生物分子溶于 PBS 或 Tris 缓冲液
- 2加入 CuSO₄ 溶液（终浓度 0.1–0.5 mM）和 THPTA 配体（Cu:THPTA = 1:5–1:10）
- 3加入新鲜配制的抗坏血酸钠（终浓度 1–5 mM）作为还原剂
- 4加入叠氮/炔基修饰荧光染料（终浓度 0.1–1 mM）
- 5室温或 37°C 反应 30 min – 2 小时
- 6脱盐或透析去除铜催化剂和未反应染料
💡 注意事项：铜催化剂浓度需根据底物量优化。细胞内标记推荐使用无铜点击化学（SPAAC）。
SYBR Green I qPCR 反应体系
qPCR使用启和 ProMaster® qPCR 预混液（含 SYBR Green I）进行实时荧光定量 PCR 的标准方案。
操作步骤
- 1冰上配制反应混合液（20 μL 体系）：2× ProMaster Mix 10 μL + 上下游引物各 0.4 μL（终浓度 0.2 μM）+ 模板 DNA < 100 ng + 补 ddH₂O 至 20 μL
- 2轻柔混匀，短暂离心消除气泡
- 3上机运行：95°C 3 min → [95°C 10 s → 60°C 30 s（采集荧光）] × 40 循环
- 4熔解曲线分析：95°C 15 s → 60°C 1 min → 以 0.5°C/s 升温至 95°C（连续采集荧光）
- 5使用 ΔΔCt 法或标准曲线法进行定量分析
💡 注意事项：推荐做 3 个技术重复。引物效率在 90%–110% 范围内为合格。
荧光原位杂交 (FISH)
细胞成像使用荧光标记寡核苷酸探针对固定细胞/组织中的特定核酸序列进行原位检测。
操作步骤
- 1细胞或组织切片固定（4% PFA，室温 15–20 min），PBS 洗涤 3 次
- 2透化处理：0.5% Triton X-100 in PBS，室温 10 min
- 3预杂交：加入预杂交液，37–42°C 孵育 30–60 min
- 4杂交：加入荧光标记探针（5–50 ng/μL 于杂交液中），37–42°C 避光 2–16 h
- 5洗涤：依次用 2× SSC + 0.1% Tween-20（37°C）洗 2–3 次，每次 5–15 min
- 6DAPI 复染细胞核（1 μg/mL，室温 5 min），PBS 洗
- 7抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察
💡 注意事项：探针长度、GC 含量和杂交温度需根据靶序列优化。避光操作防止荧光淬灭。
BCA 法蛋白定量
基础实验使用 BCA (Bicinchoninic Acid) 法测定蛋白浓度，适用于大多数蛋白/多肽样品。
操作步骤
- 1配制 BSA 标准品梯度：0、25、50、100、200、500、1000、2000 μg/mL
- 2将标准品和待测样品各 25 μL 加入 96 孔板（每个做复孔）
- 3按 A 液 : B 液 = 50 : 1 配制 BCA 工作液
- 4每孔加入 200 μL BCA 工作液，37°C 孵育 30 min
- 5冷却至室温，酶标仪读取 A₅₆₂ 吸光度
- 6以标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线
- 7根据标准曲线计算样品蛋白浓度
💡 注意事项：BCA 法对还原剂（DTT、β-ME）和螯合剂（EDTA）敏感，需控制浓度。
需要更多实验方案？联系我们的技术支持团队
info@qihe-bio.com