抗体内化
比较靶标阳性和阴性样品，记录时间序列。结合抗体结合活性，判断荧光变化是否与受体介导的内化相关。
pHrodo 荧光标记系列
用于抗体内化、细胞内吞与酸化研究。
pH560、pH630 与 pHAb，提供 6 款反应性染料及 1 款配套标记试剂。
酸化后荧光增强原理示意
- 结合
- 内吞
- 酸化
产品选型
先确认检测波段，再按目标分子的伯胺或游离巯基选择反应形式。
6 款产品
| 产品 | 反应形式 | 光谱峰值 nm | 包装规格 | 产品详情 |
|---|---|---|---|---|
| pH560 Red TFP 酯 QH-17-1005 | TFP | 560 / 585 nm | 100 μg / 1 mg | |
| pH560 Red 马来酰亚胺 QH-17-1004 | Maleimide | 560 / 585 nm | 100 μg / 1 mg | |
| pH630 Deep Red TFP 酯 QH-17-1001 | TFP | 640 / 655 nm | 100 μg / 1 mg | |
| pH630 Deep Red 马来酰亚胺 QH-17-1002 | Maleimide | 640 / 655 nm | 100 μg / 1 mg | |
| pHAb 胺反应型染料 QH-17-2001 | NHS Ester | 532 / 560 nm* | 250 μg / 1 mg | |
| pHAb 巯基反应型染料 QH-17-2002 | Maleimide | 532 / 560 nm* | 250 μg / 1 mg |
* pHAb 为吸收 / 发射峰值；其余为激发 / 发射峰值。
pH 响应与检测条件
荧光随环境酸化增强。读数同时受标记量、内化量、局部 pH 和采集条件影响；比较实验时应保持标记度和仪器设置一致。
实验设计与结果判断
内吞与酸化
把探针与待追踪分子偶联后再检测。使用独立的定位或酸化对照，区分摄取量变化和细胞器酸度变化。
多色检测
按实际激发、发射峰和滤光片带宽安排通道。采用单染对照评估串色，避免把仪器自动增益变化当成样品差异。
标记路线与应用
伯胺标记
TFP / NHS Ester · NH₂pH560 / pH630 TFP 酯与 pHAb NHS Ester。适用于含可用伯胺的抗体或蛋白，标记前去除竞争性胺和载体蛋白。
游离巯基标记
Maleimide · SHpH560 / pH630 Maleimide 与 pHAb 巯基染料。确认可用巯基，评价还原对蛋白结构的影响，并处理竞争性巯基试剂。
抗体内化
比较靶标阳性和阴性样品，记录时间序列。结合抗体结合活性，判断荧光变化是否与受体介导的内化相关。
内吞与酸化
把探针与待追踪分子偶联后再检测。使用独立的定位或酸化对照，区分摄取量变化和细胞器酸度变化。
多色检测
按实际激发、发射峰和滤光片带宽安排通道。采用单染对照评估串色，避免把仪器自动增益变化当成样品差异。
技术文章
pHrodo 抗体内化检测与产品选型
比较 pHAb、pH560 Red、pH630 Deep Red 与人源抗体配套标记试剂的检测通道和反应路线，结合样品状态安排内化检测。
NHS 酯与 Maleimide 的抗体标记路线
NHS 酯用于伯胺标记，马来酰亚胺用于游离巯基标记。结合抗体可用基团、缓冲液与还原处理，判断两种路线的适用条件，并列出标记前应提供的样品信息。
抗体标记度 DOL 的计算与评估
DOL 表示纯化后平均每个抗体结合的染料分子数。本文说明如何用 A280、染料吸光度和对应消光系数计算标记度，排查游离染料、错误校正和过度标记，并结合实际染色表现判断标记结果。
pHrodo 抗体内化的对照设计与读数分析
用对照区分靶向摄取、非特异摄取和酸化变化；明确荧光读数能回答的问题。
pHrodo 高背景与弱信号排查
按“无细胞响应—结合—细胞读数”定位问题，避免一开始就增加染料或抗体用量。
pH630 人源抗体标记的样品与对照设置
针对 QH-17-1003 核对液体制剂、抗体适用性和背景对照，避免套用游离染料流程。
相关文献
以下为方法与应用研究，所用试剂见各篇原文，不作为启和产品的验证数据。
Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye
Nath N, et al. · J Immunol Methods. 2016;431:11–21.
研究要点与应用
- 研究体系
- pHAb 标记的曲妥珠单抗（HER2）与西妥昔单抗（EGFR），采用微孔板荧光读数。
- 方法要点
- 比较胺反应、巯基反应及染料/抗体比例对内化检测的影响。
- 实验设计中的用途
- 用于设计标记路线与结合活性的平行比较。论文中的比例属于其抗体和染料体系，不能直接作为所有产品的投料条件。
Intracellular Delivery and Trafficking Dynamics of a Lymphoma-Targeting Antibody–Polymer Conjugate
Berguig GY, et al. · Mol Pharm. 2012;9(12):3506–3514.
研究要点与应用
- 研究体系
- CD22 阳性细胞中的 HD39 抗体体系，使用 Alexa Fluor 488 与 pHrodo 双标记。
- 方法要点
- 结合比率荧光、成像与流式检测，分析标记分子经历的胞内酸度变化。
- 实验设计中的用途
- 适合了解参照通道与校准的作用。单通道强度或未经校准的双通道比值，都不能直接换算为绝对 pH。
Avelumab internalization by human circulating immune cells is mediated by both Fc gamma receptor and PD-L1 binding
Jin H, et al. · Oncoimmunology. 2021;10(1):1958590.
研究要点与应用
- 研究体系
- pHrodo 标记的 avelumab 及抗体变体，研究人血液免疫细胞中的摄取。
- 方法要点
- 区分 Fcγ 受体结合与 PD-L1 结合对抗体内化的贡献。
- 实验设计中的用途
- 涉及免疫细胞时，应考虑 Fc 相关摄取，不能把全部荧光归因于靶点。是否加入 Fc 阻断取决于研究目的。
Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores
Liao-Chan S, et al. · PLoS One. 2015;10(4):e0124708.
研究要点与应用
- 研究体系
- Alexa Fluor 标记的抗 EphA2 抗体，配合抗荧光团抗体淬灭细胞表面信号。
- 方法要点
- 通过区分表面与胞内信号，追踪抗体内化；不依赖酸性荧光增强。
- 实验设计中的用途
- 为摄取量与酸化变化提供互补验证思路。所用淬灭抗体针对 Alexa 荧光团，不应直接用于 pHrodo 染料。
产品资料申请
点击所需资料，留下接收邮箱；申请 CoA 时请提供产品批号。
pH560 Red TFP 酯
QH-17-1005
pH560 Red 马来酰亚胺
QH-17-1004
pH630 Deep Red TFP 酯
QH-17-1001
pH630 Deep Red 马来酰亚胺
QH-17-1002
pHAb 胺反应型染料
QH-17-2001
pHAb 巯基反应型染料
QH-17-2002
pH630 Deep Red anti-human 标记试剂
QH-17-1003
常见问题
pH560、pH630 和 pHAb 怎么选？
先看仪器通道，再看标记对象。pH560 的激发/发射峰为 560/585 nm，pH630 为 640/655 nm；pHAb 说明书列出的吸收/发射峰为 532/560 nm。确定波段后，再按伯胺或游离巯基选择反应形式。
查看相关技术文章 →TFP、NHS Ester 和 Maleimide 分别适合什么样品？
TFP 和 NHS Ester 用于含可接近伯胺的抗体或蛋白；Maleimide 用于可接近的游离巯基。选择巯基路线前，要确认样品是否已有可用巯基，以及还原是否会影响蛋白结构和结合活性。
查看相关技术文章 →这些染料能直接加入细胞吗？
六款反应性染料需要先标记目标分子并去除游离染料，再用于细胞检测。anti-human 标记试剂则按专用流程先与待测人源抗体混合。它们都不是直接加入细胞即可使用的通用胞内 pH 探针。
各系列可以用同一种溶剂配制吗？
不能统一配制。pH560、pH630 反应性染料使用无水 DMSO 或 DMF；pHAb 使用 DMSO/水（1:1）。anti-human 是液体制剂，无需复溶，也不按游离染料方式配制。
查看相关技术文章 →所有产品都放在 −20°C 保存吗？
保存要求有差别。pH560、pH630 反应性染料按说明避光、干燥保存于 −20°C；anti-human 液体试剂也在 −20°C 避光保存。pHAb 干态染料在 −30°C 至 −10°C 可保存 1 个月，长期保存需低于 −65°C。
荧光越强，就说明内化越多吗？
不一定。信号还受局部 pH、标记度和细胞数量影响。比较不同抗体时，应同时记录结合活性与标记度；需要区分摄取和酸化时，增加独立的胞内定位或摄取读数。
查看相关技术文章 →能把荧光强度直接换算成细胞内 pH 吗？
不能直接换算。单通道强度同时受探针量和酸度影响。绝对 pH 测量需要合适的参照读数，并在实际检测体系中校准；产品曲线不能代替细胞实验校准。
查看相关技术文章 →标记后没有明显信号，先查什么？
先核对通道和采集设置，再检查偶联物在酸性条件下是否有响应。若酸性响应正常，再检查标记后结合活性、靶标表达和细胞状态。这样可以分开判断探针、检测系统和细胞实验的问题。
查看相关技术文章 →需要对应产品的操作说明？
申请说明书时，可附上抗体类型和检测需求。