先将问题定位到一个环节

保留同一批偶联物，先比较匹配浓度下的酸性与中性响应，再核对标记后结合活性，最后检查细胞内信号。每轮只改变一个主要因素，同时保留原条件，才能判断改善来自纯化、标记、样品状态还是采集设置。

按现象选择下一步

下表用于缩小原因范围。单个检查结果通常不足以证明内化改变，应与对应对照一起判断。

现象优先检查下一步判读
无细胞孔也很亮培养基 pH、游离染料残留、试剂或培养基自发荧光。分开测培养基空白和偶联物；先排除化学背景。
阳性与阴性细胞都亮聚集、Fc 受体、非特异摄取，以及两组细胞状态。增加匹配同型对照；是否测试 Fc 阻断由研究目的决定。
无细胞酸性样品仍很弱通道设置、探针浓度、配液保存和偶联物状态。此时先检查探针和检测系统，不宜直接归因于细胞内化。
酸性响应正常，细胞信号弱标记后结合活性、靶标表达、细胞活性和检测时间。用独立定位或摄取读数检查分子是否已进入细胞。
处理后荧光下降细胞数变化、酸化变化、光漂白和信号饱和。结合细胞计数与独立摄取读数，再判断是否为内化减少。
孔间或视野差异很大铺板、聚集、边缘效应、对焦与细胞分割。检查原始图像和细胞数，避免只比较总荧光。

出现强信号也要核对特异性

提高染料负载或抗体浓度可能同时提高目标信号和背景。评估候选条件时同时查看阳性样品、阴性样品、细胞活性和结合表现；目标信号更高而阴性同步上升，未必改善区分能力。

保留可复查的实验记录

记录货号与批号、抗体类型及浓度、制剂组分、标记和纯化方式、可获得的标记度、细胞型号、时间点及仪器设置。遇到问题时提供未染、阴性、阳性和酸性响应的原始读数，比单独一张最终图更容易定位原因。

比较 pHrodo 全系列

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