先识别染料与样品的反应端
NH2 是染料自身的游离氨基。采用 SMCC 桥接时，染料氨基先与 SMCC 的 NHS 端连接，保留 Maleimide 端，再与目标分子的游离巯基反应。抗体赖氨酸与染料氨基不能靠直接混合形成该连接。目标应有可用巯基或经过适用的巯基引入步骤。
分开准备染料和巯基样品
染料与 SMCC 按各自溶解性配制，并在第一步排查 Tris、甘氨酸等竞争伯胺。目标样品单独评估游离巯基和功能；还原处理后清除 DTT、β-巯基乙醇等竞争巯基试剂，TCEP 残留也应检查。不要将未经验证的还原处理同时加到全部组分中。
第一步后分离染料中间体
连接染料氨基后，需清除未反应 SMCC，否则它可继续消耗目标位点或造成交联。按染料中间体与游离试剂的大小、极性和保留行为选择色谱或其他分离方法，并检查产物身份。小分子染料不能直接照搬蛋白脱盐柱的回收方式；应先确认中间体进入哪一组分。
第二步连接与最终纯化
将已确认的 Maleimide 染料中间体加入游离巯基目标，按实际样品与中间体确定反应条件。两步具有不同的活性端和水解风险，分别记录 pH、时间、温度及投料。连接后分离未反应染料和聚集物，再测目标回收、标记度及结合或其他功能。
用对照定位低信号和高背景
产物荧光只能证明存在染料，不能单独证明连接成功。结合产物分析、无 SMCC 和无可用巯基对照，区分中间体形成不足、巯基不可用与非特异吸附。
| 检查项 | 需要确认的结果 |
|---|---|
| 第一步中间体 | 染料连接身份、回收，以及游离 SMCC 的清除 |
| 目标巯基 | 巯基可用性、还原剂残留与目标功能 |
| 阴性对照 | 无桥接或无巯基条件下的染料吸附 |
| 最终产物 | 纯化后的标记度、回收、背景及功能 |