DBCO
目标分子上可接近的叠氮基团
DBCO
应变炔R–N₃
叠氮基团三唑
SPAAC 连接DBCO 是应变炔，可与叠氮发生环加成。普通未修饰蛋白不具备这种配对位点；游离叠氮修饰试剂可能竞争消耗 DBCO。
Eu-Cryptate 染料总览
Eu-Cryptate：DBCO、NH2。按样品反应位点与检测通道选型。
2 款产品
产品选型
2 个匹配产品
| 产品 / 货号 | 反应形式 | 激发峰 / nm | 发射峰 / nm | 包装规格 | 产品详情 |
|---|---|---|---|---|---|
| Eu-Cryptate NH2QH-18-1002（NH2） | NH2 | 298 | 617 | 1 mg / 10 mg | |
| Eu-Cryptate DBCOQH-18-1001（DBCO） | DBCO | 298 | 617 | 100 μg / 500 μg / 1 mg / 5 mg / 10 mg |
需要确认反应形式或检测通道？
光谱与检测条件
参考产品
Eu-Cryptate NH2QH-18-1002（NH2）
通道配置与对照
- 核对激发光源和发射滤光片的完整通带，再按实际采集设置运行单染对照。
- 以纯化后的偶联物评价信号、背景和串色；比较不同标记物时保持标记度、样品处理及检测设置一致。
- 峰值波长不足以确定光谱重叠、亮度或补偿量；测量条件按具体产品申请。
Eu-Cryptate 各产品波长
| 产品 / 货号 | 产品形式 | Ex / Em · nm |
|---|---|---|
| Eu-Cryptate DBCOQH-18-1001（DBCO） | DBCO | 298 / 617 |
| Eu-Cryptate NH2QH-18-1002（NH2） | NH2 | 298 / 617 |
应用与标记路线
时间分辨检测中的供体
Eu-Cryptate 用作长寿命发光标记，采集时需设置适用激发、延迟和积分窗口。构建 TR-FRET 时，还需匹配受体与两者的接近关系。
NH2
活化羧基；或经 SMCC 等桥接的游离巯基
1 · 引入 Maleimide，去除游离 SMCC
NH₂
染料游离氨基SMCC
NHS / MaleimideMal
染料–Maleimide 中间体2 · 连接目标游离巯基
Mal
纯化后的中间体R–SH
目标游离巯基S–R
硫醚连接NH2 是染料提供的伯胺，不是 NHS 活性酯。两个未活化的伯胺不会直接连接。选择羧基活化路线，或先将染料氨基与 SMCC 的 NHS 端反应，再用其 Maleimide 端连接目标巯基。
把连接步骤与读数分开评价
先确认标记产物和游离供体分离，再在同一采集配置下比较空白、供体单独、受体单独及完整反应。
选型要点
匹配检测通道
根据具体产品的激发、发射参数与仪器光源、滤片或探测器比较；产品名中的数字不替代技术参数。
选择供体连接形式
NH2 形式用于活化羧基或桥接步骤；DBCO 形式用于叠氮目标。检测仪器须支持所需时间分辨模式，常规荧光峰值参数不构成完整 TR-FRET 方法。
评价最终偶联物
在相同样品量和采集条件下比较特异信号、阴性背景和功能，以纯化后的偶联物确定工作用量。
样品与实验准备
规划反应与纯化
列明目标分子量、浓度、已有反应位点及缓冲添加物，选择能分离目标产物和游离染料的方法。不同反应形式使用各自的产品条件。
记录完整采集条件
在比较样品前固定光源、滤片、延迟、积分和信号计算方式，使用同样条件测对照。供受体用量分别滴定并检查非结合背景。
保留未标记基线
保留同批未标记样品；纯化后再进行浓度、标记度及功能检测。多色检测使用实际偶联物设置单染参考。
技术文章
SPAAC 前样品与缓冲液检查
目标叠氮用于偶联；游离叠氮修饰试剂和叠氮化钠可能竞争消耗 DBCO。
SPAAC 弱信号与高背景排查
用产物分析区分转化不足与检测偏差，用无叠氮对照排查吸附背景。
Azide 与 DBCO 点击反应配对
末端炔与 Azide 采用 CuAAC；DBCO 与叠氮采用无铜 SPAAC。
NH2 染料的 SMCC 分步偶联
连接染料氨基、分离中间体，再与目标巯基反应；重点检查游离 SMCC、竞争还原剂和小分子分离。
Maleimide 标记前还原剂处理
DTT、β-巯基乙醇会竞争消耗 Maleimide；TCEP 残留也可能干扰反应。
荧光标记产物评价
纯化后同时比较标记度、样品回收、特异信号和背景，避免用总荧光判断效果。
相关文献
稀土穴状配合物与均相时间分辨免疫分析
Mathis G. · Clinical Chemistry · 39(9):1953–1959 · 1993
介绍铕穴状配合物供体、受体间能量转移及时间分辨信号校正，可用于规划供体、受体与背景对照。
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Thermo Fisher Scientific · SMCC and Sulfo-SMCC · MAN0011295 Rev. C.0
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以氮杂二苯并环辛炔进行无铜环加成与酶 PEG 化
Debets MF, van Berkel SS, Schoffelen S, et al. · Chemical Communications · 46(1):97–99 · 2010
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以应变促进的叠氮–炔基环加成修饰生物分子
Agard NJ, Prescher JA, Bertozzi CR. · Journal of the American Chemical Society · 126(46):15046–15047 · 2004
介绍利用环张力实现无铜叠氮–炔基偶联的策略，是 SPAAC 生物偶联的基础研究。
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Thermo Fisher · 巯基反应化学
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TCEP 与 Maleimide 及 α-卤代酰基的反应
Shafer DE, Inman JK, Lees A. · Analytical Biochemistry · 282(1):161–164 · 2000
研究 TCEP 与反应性基团的相互作用，可用于评估还原剂残留及换液方案。
产品资料申请
按货号申请说明书、SDS 或批次 CoA；申请 CoA 时请提供瓶签批号。
产品说明书
产品用途、配制、使用条件与储存要求。
批次分析证书（CoA）
对应批次的检验项目与结果。
安全数据表（SDS）
安全操作、储存及应急处置信息。
常见问题
如何选择产品形式？
先确认样品已有反应位点或需要的识别方式，再选择相应反应性染料或已有偶联物。具体货号分别使用其配制、反应与保存要求。
单个 Eu-Cryptate 标记物能代表 TR-FRET 结果吗？
TR-FRET 需要适用受体、供受体接近及对应检测设置。先验证完整体系，再评价目标结合或其他分析终点。
如何比较两种标记产物？
保持目标浓度、采集设置及样品处理一致，结合标记度比较特异信号、阴性背景、回收率和样品功能。单看游离染料或一次终点强度不能评价全部性能。
标记度计算需要哪些参数？
需使用具体货号的分子量、适用消光系数及蛋白吸收校正参数，并先清除游离染料。未公开的参数可在产品资料标签按货号申请。