按对照定位背景
未染样品用于观察自发荧光；仅加荧光链霉亲和素的样品显示内源性生物素及吸附相关背景；省略生物素化探针的匹配流程用于检查上游试剂影响。这些对照需与完整染色采用相同采集设置。
同时保留目标信号
固定上游探针条件，分别比较链霉亲和素用量、封闭或洗涤。记录阳性目标与阴性区域的变化；背景下降但目标信号同步消失，不能视为检测改善。
省略探针的对照如何使用
无生物素化一抗或探针的对照仍可出现内源性生物素信号。若使用生物素封闭流程，必须按规定顺序封闭并充分清洗，否则残留生物素也可能消耗随后加入的荧光链霉亲和素。