有效染料与反应条件
检查染料是否受潮、配制后是否长时间放置，以及实际反应 pH。NHS 酯接触水后会水解，提高 pH 也会加快水解。发现 Tris、甘氨酸或载体蛋白时，先解决竞争反应，再比较染料投料。
按测定结果定位问题
纯化后测 DOL 和目标浓度。DOL 低时排查有效染料与可用伯胺；回收量低时检查沉淀及纯化损失；DOL 已提高但特异结合下降时，比较较低投料条件。各组使用相同目标浓度和仪器设置。
按结果决定下一步
先在相同目标浓度和采集设置下比较，避免把样品损失或设置变化解释为反应失败。
| 观察结果 | 优先检查 |
|---|---|
| DOL 低，回收量正常 | 染料受潮或水解、竞争性胺、实际 pH、可接近伯胺 |
| DOL 正常，目标回收量低 | 沉淀、纯化柱或膜的吸附，以及收集体积 |
| DOL 高，结合能力下降 | 与未标记及仅前处理组比较，再降低投料做平行试验 |
| 阴性样品也很亮 | 游离染料残留、工作浓度、非特异结合与通道串色 |