DOL 的计算前提
充分去除游离染料后测吸收光谱，记录稀释倍数和光程，并校正染料对蛋白定量波长的贡献。DOL 是平均每个抗体结合的染料数，不能反映位点分布或各分子的均一性。
按检测效果选择条件
对候选偶联物做工作浓度滴定，在固定仪器设置下比较阳性样品与适用阴性样品的信号。优先选择能分离阳性与背景、且保留结合活性的条件；同时记录回收率，避免仅追求高 DOL。
投料比换算示例
10 mg、分子量 160,000 g/mol 的 IgG 为 62.5 nmol。15–25 µL 的 10 mM 染料含 150–250 nmol，对应 2.4–4:1 投料比。这是物质的量换算示例，不是通用的推荐投料范围。
投料比与 DOL 分开记录
投料比是加入反应的染料摩尔量与目标摩尔量之比；DOL 是纯化后平均每个目标分子结合的染料数。未反应、水解或在纯化中损失的染料不会计入有效 DOL。参数表中的 IgG 建议 DOL 不能直接作为投料比。
用吸收值计算 DOL
先扣除缓冲液本底并去除游离染料。下式要求 A280 与 Adye 来自同一稀释样品、同一光程。Adye 在染料定量波长测量；CF280、εdye 按具体染料取得，εprotein 按目标蛋白取得。校正后的 A280 应为正值。
| 计算项 | 公式与含义 |
|---|---|
| 蛋白校正吸收 | A280,corr = A280 − CF280 × Adye |
| 蛋白浓度 | Cprotein = A280,corr × D ÷ (εprotein × l) |
| 染料浓度 | Cdye = Adye × D ÷ (εdye × l) |
| 平均标记度 | DOL = Cdye ÷ Cprotein |
| 单位 | D：稀释倍数；l：光程（cm）；ε：M⁻¹ cm⁻¹；C：mol/L |