确认游离巯基
核对半胱氨酸的二硫键、保护基和暴露情况。需要测定巯基时，先检查缓冲液中的还原剂是否干扰读数。序列中的半胱氨酸总数不能作为可反应巯基数。
区分还原损伤与标记影响
比较未经处理、仅还原和还原后标记的样品，检查回收、聚集及结合或酶活。如果仅还原组已经出现功能下降，应先调整前处理，而非继续提高染料用量。
巯基状态与还原前处理
半胱氨酸可能处于二硫键或受保护状态；先确认游离巯基，再决定是否还原。
AF–Maleimide
R–SH
硫醚连接
仅示意连接关系，未展示完整化学结构。 AF 色点表示通用染料符号。