DBCO
目标分子上可接近的叠氮基团
DBCO
应变炔R–N₃
叠氮基团三唑
SPAAC 连接DBCO 是应变炔，可与叠氮发生环加成。普通未修饰蛋白不具备这种配对位点；游离叠氮修饰试剂可能竞争消耗 DBCO。
SF435 染料总览
SF435：DBCO、NH2。按样品反应位点与检测通道选型。
2 款产品
产品选型
2 个匹配产品
| 产品 / 货号 | 反应形式 | 激发峰 / nm | 发射峰 / nm | 包装规格 | 产品详情 |
|---|---|---|---|---|---|
| SF435-NH2QH-12-1003(NH2) | NH2 | 430 | 545 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| SF435-DBCOQH-12-1003(DBCO) | DBCO | 430 | 545 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg |
需要确认反应形式或检测通道？
光谱与检测条件
参考产品
SF435-NH2QH-12-1003(NH2)
通道配置与对照
- 核对激发光源和发射滤光片的完整通带，再按实际采集设置运行单染对照。
- 以纯化后的偶联物评价信号、背景和串色；比较不同标记物时保持标记度、样品处理及检测设置一致。
- 峰值波长不足以确定光谱重叠、亮度或补偿量；测量条件按具体产品申请。
SF435 各产品波长
| 产品 / 货号 | 产品形式 | Ex / Em · nm |
|---|---|---|
| SF435-DBCOQH-12-1003(DBCO) | DBCO | 430 / 545 |
| SF435-NH2QH-12-1003(NH2) | NH2 | 430 / 545 |
应用与标记路线
SF435 的两种连接路线
SF435 提供染料端为游离氨基的 NH2 形式，以及与样品叠氮配对的 DBCO 形式。两者按已有位点、可接受的反应步骤和纯化条件选择。
NH2
活化羧基；或经 SMCC 等桥接的游离巯基
1 · 引入 Maleimide，去除游离 SMCC
NH₂
染料游离氨基SMCC
NHS / MaleimideMal
染料–Maleimide 中间体2 · 连接目标游离巯基
Mal
纯化后的中间体R–SH
目标游离巯基S–R
硫醚连接NH2 是染料提供的伯胺，不是 NHS 活性酯。两个未活化的伯胺不会直接连接。选择羧基活化路线，或先将染料氨基与 SMCC 的 NHS 端反应，再用其 Maleimide 端连接目标巯基。
信号与功能同时评价
用同批样品比较纯化后的产物，记录投料、回收、阴性背景及功能。比较不同染料时，匹配目标量和检测设置，再分别评价强度、光漂白或其他终点。
选型要点
匹配检测通道
根据具体产品的激发、发射参数与仪器光源、滤片或探测器比较；产品名中的数字不替代技术参数。
按已有位点选 NH2 或 DBCO
NH2 染料需要活化羧基或桥接路线；DBCO 需要目标带有可用叠氮。先确认目标修饰状态，再比较所需步骤和清除游离组分的方法。
评价最终偶联物
在相同样品量和采集条件下比较特异信号、阴性背景和功能，以纯化后的偶联物确定工作用量。
样品与实验准备
NH2 桥接中间体
采用 SMCC 路线时，先连接染料氨基，清除游离交联剂后再与目标巯基反应。按中间体大小选择分离方法，不能默认使用蛋白脱盐柱保留小分子染料。
DBCO 点击前检查
确认目标叠氮引入并清除游离叠氮试剂，检查缓冲液中的叠氮化钠及其他竞争小分子。以无叠氮目标对照排查吸附背景。
保留未标记基线
保留同批未标记样品；纯化后再进行浓度、标记度及功能检测。多色检测使用实际偶联物设置单染参考。
技术文章
SPAAC 前样品与缓冲液检查
目标叠氮用于偶联；游离叠氮修饰试剂和叠氮化钠可能竞争消耗 DBCO。
SPAAC 弱信号与高背景排查
用产物分析区分转化不足与检测偏差，用无叠氮对照排查吸附背景。
Azide 与 DBCO 点击反应配对
末端炔与 Azide 采用 CuAAC；DBCO 与叠氮采用无铜 SPAAC。
NH2 染料的 SMCC 分步偶联
连接染料氨基、分离中间体，再与目标巯基反应；重点检查游离 SMCC、竞争还原剂和小分子分离。
巯基状态与还原前处理
半胱氨酸可能处于二硫键或受保护状态；先确认游离巯基，再决定是否还原。
荧光标记产物评价
纯化后同时比较标记度、样品回收、特异信号和背景，避免用总荧光判断效果。
相关文献
SMCC 的伯胺–巯基分步连接方法
Thermo Fisher Scientific · SMCC and Sulfo-SMCC · MAN0011295 Rev. C.0
区分 NHS 端与 Maleimide 端的反应对象、反应顺序和游离交联剂清除，支持设计 NH2 染料的桥接路线。
以氮杂二苯并环辛炔进行无铜环加成与酶 PEG 化
Debets MF, van Berkel SS, Schoffelen S, et al. · Chemical Communications · 46(1):97–99 · 2010
研究应变炔与叠氮的无铜反应及酶 PEG 化，介绍应变炔在生物偶联中的应用。
DOI: 10.1039/b917797c
以应变促进的叠氮–炔基环加成修饰生物分子
Agard NJ, Prescher JA, Bertozzi CR. · Journal of the American Chemical Society · 126(46):15046–15047 · 2004
介绍利用环张力实现无铜叠氮–炔基偶联的策略，是 SPAAC 生物偶联的基础研究。
DOI: 10.1021/ja044996f
Thermo Fisher · 伯胺反应化学
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反应基团、缓冲液相容性与操作方法。
Thermo Fisher · 巯基反应化学
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TCEP 与 Maleimide 及 α-卤代酰基的反应
Shafer DE, Inman JK, Lees A. · Analytical Biochemistry · 282(1):161–164 · 2000
研究 TCEP 与反应性基团的相互作用，可用于评估还原剂残留及换液方案。
产品资料申请
按货号申请说明书、SDS 或批次 CoA；申请 CoA 时请提供瓶签批号。
产品说明书
产品用途、配制、使用条件与储存要求。
批次分析证书（CoA）
对应批次的检验项目与结果。
安全数据表（SDS）
安全操作、储存及应急处置信息。
常见问题
如何选择产品形式？
先确认样品已有反应位点或需要的识别方式，再选择相应反应性染料或已有偶联物。具体货号分别使用其配制、反应与保存要求。
NH2 能直接按 NHS 酯流程标记抗体吗？
NH2 是染料本身的游离氨基。与抗体赖氨酸等普通伯胺之间需设计活化或桥接步骤，不能省去连接路线直接混合。
如何比较两种标记产物？
保持目标浓度、采集设置及样品处理一致，结合标记度比较特异信号、阴性背景、回收率和样品功能。单看游离染料或一次终点强度不能评价全部性能。
标记度计算需要哪些参数？
需使用具体货号的分子量、适用消光系数及蛋白吸收校正参数，并先清除游离染料。未公开的参数可在产品资料标签按货号申请。