NHS Ester
蛋白 N 端、赖氨酸及人工引入的伯胺
NHS
活性酯R–NH₂
伯胺CO–NH–R
酰胺连接NHS 酯与伯胺形成酰胺键，水解会消耗活性酯。蛋白上的可用位点通常不止一个，投料比不等于最终标记度。
ROX 染料总览
ROX：NHS Ester、Free acid。按样品反应位点与检测通道选型。
3 款产品
产品选型
3 个匹配产品
| 产品 / 货号 | 反应形式 | 激发峰 / nm | 发射峰 / nm | 包装规格 | 产品详情 |
|---|---|---|---|---|---|
| 6-ROX free acidQH-60-6011 | Free acid | 568 | 585 | 10 mg | |
| 5-ROX NHS EsterQH-60-6016 | NHS Ester | 570 | 591 | 5 mg | |
| 6-ROX Succinimidyl EsterQH-60-6010 | NHS Ester | 578 | 602 | 5 mg |
需要确认反应形式或检测通道？
光谱与检测条件
参考产品
6-ROX Succinimidyl EsterQH-60-6010
通道配置与对照
- 核对激发光源和发射滤光片的完整通带，再按实际采集设置运行单染对照。
- 以纯化后的偶联物评价信号、背景和串色；比较不同标记物时保持标记度、样品处理及检测设置一致。
- 峰值波长不足以确定光谱重叠、亮度或补偿量；测量条件按具体产品申请。
ROX 各产品波长
| 产品 / 货号 | 产品形式 | Ex / Em · nm |
|---|---|---|
| 5-ROX NHS EsterQH-60-6016 | NHS Ester | 570 / 591 |
| 6-ROX free acidQH-60-6011 | Free acid | 568 / 585 |
| 6-ROX Succinimidyl EsterQH-60-6010 | NHS Ester | 578 / 602 |
应用与标记路线
ROX 异构体与活化形式
5-ROX NHS Ester; 6-ROX free acid; 6-ROX Succinimidyl Ester 分别对应明确的位点异构体与活化形式。按异构体和 Free acid / NHS Ester 形式记录原料与产物，分别进行摩尔量计算。
Free acid
经适用活化路线连接的伯胺
COOH
羧基染料CO–X
活化羧基CO–NH–R
酰胺连接游离羧酸不是预活化 NHS 酯。需采用与样品相容的活化步骤，再与可用伯胺形成连接；未经活化不能按 NHS 标记条件使用。
用于明确的共价标记路线
NHS Ester 用于可用伯胺；Free acid 需活化后连接。用于核酸探针时，先确认氨基修饰位点，纯化后检查全长产物、游离染料残留与探针功能。
选型要点
匹配检测通道
根据具体产品的激发、发射参数与仪器光源、滤片或探测器比较；产品名中的数字不替代技术参数。
同时核对异构体与反应端
按具体探针或偶联物设计选择异构体和反应形式；使用对应货号的分子量与检测参数，不按同一染料名称统一换算。
评价最终偶联物
在相同样品量和采集条件下比较特异信号、阴性背景和功能，以纯化后的偶联物确定工作用量。
样品与实验准备
Free acid 活化与分离
选择适用活化、偶联及分离方案，分别分析起始染料、活化中间体和目标产物。目标同时含多个羧基和氨基时，评估自交联风险。
规划反应与纯化
列明目标分子量、浓度、已有反应位点及缓冲添加物，选择能分离目标产物和游离染料的方法。不同反应形式使用各自的产品条件。
保留未标记基线
保留同批未标记样品；纯化后再进行浓度、标记度及功能检测。多色检测使用实际偶联物设置单染参考。
技术文章
NHS 标记前缓冲液检查
Tris、甘氨酸会消耗 NHS 染料；BSA、明胶需与目标蛋白分离，普通换液不能代替这一步。
NHS 标记信号不足排查
先排查 NHS 水解和含胺添加物，再区分标记不足、样品损失与结合活性下降。
抗体标记度（DOL）计算与质量评价
用吸收校正计算 DOL，区分投料比与实际标记量，再结合回收率和结合活性评价偶联物。
游离羧酸染料的活化与偶联
区分 Free acid 与 NHS Ester，规划羧基活化、伯胺连接、分离和产物鉴定，并保留 FAM、ROX 的位点异构体信息。
荧光标记产物评价
纯化后同时比较标记度、样品回收、特异信号和背景，避免用总荧光判断效果。
相关文献
EDC/NHS 羧基–伯胺偶联方法
Thermo Fisher Scientific · Carbodiimide crosslinker chemistry
介绍羧基活化、中间体水解及多位点样品自交联风险，用于规划游离羧酸染料的活化和产物分析。
用 NHS 酯对蛋白进行荧光标记
Nanda JS, Lorsch JR. · Methods in Enzymology · 536:87–94 · 2014
以 FAM 活性酯标记蛋白为例，介绍伯胺反应和标记效率评价。适合安排 NHS 标记流程，投料与反应条件需按实际染料和样品确定。
荧光标记抗体：平衡功能与标记度
Vira S, Mekhedov E, Humphrey G, Blank PS. · Analytical Biochemistry · 402(2):146–150 · 2010
以 FITC 标记抗 HA 抗体，比较标记度与抗原结合的变化。适合设计投料梯度及纯化后的功能评价，不能单凭 DOL 高低选择偶联物。
Thermo Fisher · 伯胺反应化学
thermofisher.com
反应基团、缓冲液相容性与操作方法。
产品资料申请
按货号申请说明书、SDS 或批次 CoA；申请 CoA 时请提供瓶签批号。
产品说明书
产品用途、配制、使用条件与储存要求。
批次分析证书（CoA）
对应批次的检验项目与结果。
安全数据表（SDS）
安全操作、储存及应急处置信息。
常见问题
如何选择产品形式？
先确认样品已有反应位点或需要的识别方式，再选择相应反应性染料或已有偶联物。具体货号分别使用其配制、反应与保存要求。
Free acid 可以直接替代 NHS Ester 吗？
Free acid 不是预活化试剂，需另行设计活化步骤。两种形式的分子量、溶解性和产物分析也应分别确认。
如何比较两种标记产物？
保持目标浓度、采集设置及样品处理一致，结合标记度比较特异信号、阴性背景、回收率和样品功能。单看游离染料或一次终点强度不能评价全部性能。
标记度计算需要哪些参数？
需使用具体货号的分子量、适用消光系数及蛋白吸收校正参数，并先清除游离染料。未公开的参数可在产品资料标签按货号申请。