DBCO
目标分子上可接近的叠氮基团
DBCO
应变炔R–N₃
叠氮基团三唑
SPAAC 连接DBCO 是应变炔，可与叠氮发生环加成。普通未修饰蛋白不具备这种配对位点；游离叠氮修饰试剂可能竞争消耗 DBCO。
Cy5 染料总览
Cy5 提供 Streptavidin、CTB、WGA、DBCO、Maleimide、Azide、NHS Ester 产品，按标记或染色用途选型。
7 款产品
产品选型
7 个匹配产品
| 产品 / 货号 | 反应形式 | 激发峰 / nm | 发射峰 / nm | 包装规格 | 产品详情 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cy5 NHS EsterQH-30-3003 | NHS Ester | 640 | 664 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| Cy5 MaleimideQH-30-3003(Maleimide) | Maleimide | 640 | 664 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| Cy5 AzideQH-30-3003(Azide) | Azide | 640 | 664 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| Cy5-StreptavidinQH-15-1015 | Streptavidin | 640 | 664 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| Cy5 WGAQH-30-3003(WGA) | WGA | 640 | 664 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| Cy5 CTBQH-30-3003(CTB) | CTB | 640 | 664 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg | |
| Cy5 DBCOQH-30-3003(DBCO) | DBCO | 649 | 667 | 1 mg / 5 mg / 10 mg / 25 mg / 100 mg |
需要确认反应形式或检测通道？
光谱与检测条件
参考产品
Cy5 NHS EsterQH-30-3003
通道配置与对照
- 核对激发光源和发射滤光片的完整通带，再按实际采集设置运行单染对照。
- 以纯化后的偶联物评价信号、背景和串色；比较不同标记物时保持标记度、样品处理及检测设置一致。
- 峰值波长不足以确定光谱重叠、亮度或补偿量；测量条件按具体产品申请。
Cy5 各产品波长
| 产品 / 货号 | 产品形式 | Ex / Em · nm |
|---|---|---|
| Cy5-StreptavidinQH-15-1015 | Streptavidin | 640 / 664 |
| Cy5 CTBQH-30-3003(CTB) | CTB | 640 / 664 |
| Cy5 WGAQH-30-3003(WGA) | WGA | 640 / 664 |
| Cy5 DBCOQH-30-3003(DBCO) | DBCO | 649 / 667 |
| Cy5 MaleimideQH-30-3003(Maleimide) | Maleimide | 640 / 664 |
| Cy5 AzideQH-30-3003(Azide) | Azide | 640 / 664 |
| Cy5 NHS EsterQH-30-3003 | NHS Ester | 640 / 664 |
应用与标记路线
Cy5 标记与检测
Cy5 为标记产物提供荧光读数，反应端决定与样品连接的位点。预偶联探针的识别对象由所连接的蛋白决定，按其染色用途处理。
Maleimide
可接近的游离巯基
Maleimide
巯基反应端R–SH
游离巯基C–S–R
硫醚连接Maleimide 与游离巯基加成形成含硫醚连接的产物。二硫键中的硫不是可用游离巯基；还原前处理需兼顾样品结构和功能。
Azide
末端炔或 DBCO、BCN 等适用应变炔
CuAAC · Cu(I) 催化
N₃
叠氮染料R–C≡CH
末端炔三唑
共价连接SPAAC · 无铜反应
N₃
叠氮染料R–DBCO
应变炔三唑
共价连接叠氮染料不直接标记普通伯胺或巯基。先确认目标上的炔基类型，再选择铜催化或应变促进的环加成体系。
NHS Ester
蛋白 N 端、赖氨酸及人工引入的伯胺
NHS
活性酯R–NH₂
伯胺CO–NH–R
酰胺连接NHS 酯与伯胺形成酰胺键，水解会消耗活性酯。蛋白上的可用位点通常不止一个，投料比不等于最终标记度。
Streptavidin
样品上可接近的生物素
Streptavidin
亲和识别Biotin
生物素标记目标结合
非共价亲和结合链霉亲和素与生物素非共价结合。游离生物素可占据结合位点，内源性生物素可能产生背景；多价结合还可能造成目标交联。
CTB
可接近的 GM1 神经节苷脂
CTB
荧光偶联物GM1
GM1 神经节苷脂识别结合
非共价识别CTB 为霍乱毒素 B 亚基，能够多价结合 GM1。探针本身可能改变 GM1 聚集和膜行为，因此单独的 CTB 信号不能确认脂筏数量或膜微区结构。
WGA
可接近的 N-乙酰葡糖胺及唾液酸相关糖链
WGA
荧光偶联物GlcNAc / Sia
GlcNAc / 唾液酸糖链识别结合
非共价识别WGA 为小麦胚芽凝集素。其荧光信号取决于糖链分布和可接近性；固定、通透、温度和孵育时间会改变所见分布，信号不等同于细胞膜总量。
在最终偶联物上评价信号
Cy 染料连接蛋白后，局部环境与标记密度可能改变荧光读数。以纯化后目标的等浓度梯度比较信号和背景，同时检查结合或酶活功能。
选型要点
匹配检测通道
根据具体产品的激发、发射参数与仪器光源、滤片或探测器比较；产品名中的数字不替代技术参数。
选择偶联或直接染色
需要自行标记时进入反应性染料产品；直接染色时按实际列出的 WGA、CTB 或 Streptavidin 偶联物及其识别对象选型。
比较信号与背景
按实际样品滴定产品用量，保持采集和处理条件一致，并设置用途对应的对照。
样品与实验准备
规划反应与纯化
列明目标分子量、浓度、已有反应位点及缓冲添加物，选择能分离目标产物和游离染料的方法。不同反应形式使用各自的产品条件。
分开处理游离染料与蛋白探针
蛋白偶联物按水相制剂处理；游离染料按具体货号配制。亲和染色同时记录固定、通透、温度、时间和洗涤条件。
保留未标记基线
保留同批未标记样品；纯化后再进行浓度、标记度及功能检测。多色检测使用实际偶联物设置单染参考。
技术文章
游离生物素对检测的影响
游离生物素会占据链霉亲和素结合位点，降低对生物素化目标的检测信号。
内源性生物素与非特异背景分析
用未染、仅链霉亲和素和无生物素化探针对照，区分自发荧光、内源性生物素与吸附。
链霉亲和素荧光检测与多价结合
链霉亲和素多价结合可能交联生物素化目标；活细胞运动与聚集研究需考虑这一影响。
CTB 信号与脂筏判读
CTB 荧光用于观察 GM1 相关分布；点状信号本身不能证明天然脂筏结构。
CTB 结合与内吞时序分析
CTB 时序图像应区分膜周边与胞内信号，单一终点不能确定运输路径。
CTB 神经示踪应用评估
按模型、组织和追踪时间核对文献，并确认偶联物、组织背景和检测窗口。
WGA 信号与细胞膜轮廓
WGA 标记可接近的糖链；膜轮廓分割需检查连续性，不能把强度直接当作膜总量。
WGA 表面信号与内吞区分
活细胞中的 WGA 可被内吞；胞内信号需结合时间与定位判断。
WGA 固定与通透条件比较
固定和通透会改变糖链可接近性，需分别比较膜轮廓、胞内信号和背景。
SPAAC 前样品与缓冲液检查
目标叠氮用于偶联；游离叠氮修饰试剂和叠氮化钠可能竞争消耗 DBCO。
SPAAC 弱信号与高背景排查
用产物分析区分转化不足与检测偏差，用无叠氮对照排查吸附背景。
Azide 与 DBCO 点击反应配对
末端炔与 Azide 采用 CuAAC；DBCO 与叠氮采用无铜 SPAAC。
巯基状态与还原前处理
半胱氨酸可能处于二硫键或受保护状态；先确认游离巯基，再决定是否还原。
Maleimide 标记前还原剂处理
DTT、β-巯基乙醇会竞争消耗 Maleimide；TCEP 残留也可能干扰反应。
Maleimide 标记产物评价
去除游离染料后测标记度，再检查功能及保存后的信号变化。
CuAAC 与 SPAAC 路线选择
末端炔采用 CuAAC，应变炔采用 SPAAC；确认目标基团后再检查铜与样品的兼容性。
CuAAC 转化率不足排查
反应基团、催化组分和铜结合添加物是低转化率的首要排查项。
点击标记后的纯化与背景评估
用无反应位点对照区分共价标记与吸附，纯化时同时处理游离染料和催化组分。
NHS 标记前缓冲液检查
Tris、甘氨酸会消耗 NHS 染料；BSA、明胶需与目标蛋白分离，普通换液不能代替这一步。
NHS 标记信号不足排查
先排查 NHS 水解和含胺添加物，再区分标记不足、样品损失与结合活性下降。
抗体标记度（DOL）计算与质量评价
用吸收校正计算 DOL，区分投料比与实际标记量，再结合回收率和结合活性评价偶联物。
相关文献
Cy 染料连接蛋白后的荧光变化与标记度评价
Gruber HJ, Hahn CD, Kada G, et al. · Bioconjugate Chemistry · 11(5):696–704 · 2000
比较 Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7 与 IgG 或亲和素结合后的荧光变化，说明应同时评价标记度和纯化后偶联物的实际信号。
DOI: 10.1021/bc000015m
磺化 Cy 染料活性酯的合成与生物分子标记
Mujumdar RB, Ernst LA, Mujumdar SR, Lewis CJ, Waggoner AS. · Bioconjugate Chemistry · 4(2):105–111 · 1993
研究磺化 Cy 活性酯的结构、光谱及含伯胺生物分子标记，适合了解 Cy 活性酯的标记路线。
DOI: 10.1021/bc00020a001
具有单一高亲和力结合位点的单价链霉亲和素
Howarth M, Chinnapen DJF, Gerrow K, et al. · Nature Methods · 3:267–273 · 2006
通过工程化单价蛋白研究多价结合引起的交联。可用于评估探针价态对膜蛋白运动和聚集的影响。
DOI: 10.1038/nmeth861
流式细胞术与细胞分选使用指南（第三版）
Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. · European Journal of Immunology · 51(12):2708–3145 · 2021
提供检测设置、对照及实验记录的方法参考，用于设计标记产物的下游评价。
Thermo Fisher · 生物素结合与干扰因素
Thermo Fisher Scientific
生物素亲和检测中的样品准备、游离生物素与背景控制。
GM1 的有序聚集参与霍乱毒素诱导的膜曲率变化
Kabbani AM, Raghunathan K, Lencer WI, Kenworthy AK, Kelly CV. · PNAS · 117(26):14978–14986 · 2020
研究 CTB 多价结合对 GM1 排布及膜形态的影响，提示需要评估探针对观察对象的扰动。
使用荧光 WGA 标记膜糖蛋白与糖脂
Chazotte B. · Cold Spring Harbor Protocols · 2011(5):pdb.prot5623 · 2011
介绍以 WGA 识别糖链的膜染色方法，适合参考样品处理与成像设计。
DOI: 10.1101/pdb.prot5623
以氮杂二苯并环辛炔进行无铜环加成与酶 PEG 化
Debets MF, van Berkel SS, Schoffelen S, et al. · Chemical Communications · 46(1):97–99 · 2010
研究应变炔与叠氮的无铜反应及酶 PEG 化，介绍应变炔在生物偶联中的应用。
DOI: 10.1039/b917797c
以应变促进的叠氮–炔基环加成修饰生物分子
Agard NJ, Prescher JA, Bertozzi CR. · Journal of the American Chemical Society · 126(46):15046–15047 · 2004
介绍利用环张力实现无铜叠氮–炔基偶联的策略，是 SPAAC 生物偶联的基础研究。
DOI: 10.1021/ja044996f
TCEP 与 Maleimide 及 α-卤代酰基的反应
Shafer DE, Inman JK, Lees A. · Analytical Biochemistry · 282(1):161–164 · 2000
研究 TCEP 与反应性基团的相互作用，可用于评估还原剂残留及换液方案。
还原环境中 Maleimide–巯基加成物的可调降解
Baldwin AD, Kiick KL. · Bioconjugate Chemistry · 22(10):1946–1953 · 2011
以模型加成物研究含巯基环境下的交换反应，为偶联物稳定性评价提供参考。
DOI: 10.1021/bc200148v
用于生物偶联的铜催化叠氮–炔基点击反应
Presolski SI, Hong VP, Finn MG. · Current Protocols in Chemical Biology · 3(4):153–162 · 2011
介绍 CuAAC 催化体系与反应评价，适合带末端炔基样品的方法设计。
生物偶联中 CuAAC 反应的分析与优化
Hong V, Presolski SI, Ma C, Finn MG. · Angewandte Chemie International Edition · 48(52):9879–9883 · 2009
讨论配体、铜催化与生物分子条件对反应的影响，为 CuAAC 转化不足的排查提供依据。
用 NHS 酯对蛋白进行荧光标记
Nanda JS, Lorsch JR. · Methods in Enzymology · 536:87–94 · 2014
以 FAM 活性酯标记蛋白为例，介绍伯胺反应和标记效率评价。适合安排 NHS 标记流程，投料与反应条件需按实际染料和样品确定。
荧光标记抗体：平衡功能与标记度
Vira S, Mekhedov E, Humphrey G, Blank PS. · Analytical Biochemistry · 402(2):146–150 · 2010
以 FITC 标记抗 HA 抗体，比较标记度与抗原结合的变化。适合设计投料梯度及纯化后的功能评价，不能单凭 DOL 高低选择偶联物。
产品资料申请
按货号申请说明书、SDS 或批次 CoA；申请 CoA 时请提供瓶签批号。
产品说明书
产品用途、配制、使用条件与储存要求。
批次分析证书（CoA）
对应批次的检验项目与结果。
安全数据表（SDS）
安全操作、储存及应急处置信息。
常见问题
如何选择产品形式？
先确认样品已有反应位点或需要的识别方式，再选择相应反应性染料或已有偶联物。具体货号分别使用其配制、反应与保存要求。
同名 Cy 产品的波长完全相同吗？
以具体货号为准。连接形式或已有偶联物可能有不同参数；比较时查看产品表和各货号技术参数，不能只按染料名称替代。
如何比较两种标记产物？
保持目标浓度、采集设置及样品处理一致，结合标记度比较特异信号、阴性背景、回收率和样品功能。单看游离染料或一次终点强度不能评价全部性能。
标记度计算需要哪些参数？
需使用具体货号的分子量、适用消光系数及蛋白吸收校正参数，并先清除游离染料。未公开的参数可在产品资料标签按货号申请。